親和層析空柱是生物分離純化領(lǐng)域的核心工具，通過(guò)特異性配體與目標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)現(xiàn)高效純化。其操作規(guī)范性與安全性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性與人員安全，以下從安裝、裝填、使用到維護(hù)全流程解析操作規(guī)范與關(guān)鍵注意事項(xiàng)。
一、操作前準(zhǔn)備：
1.環(huán)境要求：操作需在清潔、干燥的實(shí)驗(yàn)臺(tái)中進(jìn)行，避免粉塵、有機(jī)物污染空柱內(nèi)壁或填料。
2.物料檢查：確認(rèn)空柱無(wú)裂痕、接口螺紋完好，配套篩板、填料及緩沖液符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。
3.個(gè)人防護(hù)：佩戴手套、護(hù)目鏡及實(shí)驗(yàn)服，若涉及毒性或傳染性樣品，需額外穿戴防護(hù)面罩與防濺圍裙。
二、空柱安裝與裝填規(guī)范
1.空柱組裝：
•將下篩板(帶支撐網(wǎng)格)輕放入空柱底部，避免刮傷內(nèi)壁；
•若為空柱套裝(含上下篩板)，按說(shuō)明書順序安裝，確保篩板與柱體密封圈緊密貼合。
2.裝填填料：
•預(yù)處理填料：將親和填料(如Ni-NTA樹(shù)脂)用平衡緩沖液(如20mM Tris-HCl,pH 7.4)充分懸浮，去除保存液中的甘油或防腐劑；
•緩慢倒入：將填料懸液沿空柱內(nèi)壁勻速倒入(避免垂直沖擊導(dǎo)致篩板移位)，裝填高度建議為柱體有效體積的70%-80%(如10mL空柱裝填7-8mL填料)；
•壓實(shí)與排氣：用緩沖液沖洗柱壁殘留填料，連接恒流泵以低流速(0.5-1mL/min)通液，排除氣泡(觀察柱床無(wú)分層或空隙)，較終形成均勻、穩(wěn)定的柱床層。
三、使用過(guò)程中的關(guān)鍵規(guī)范
1.連接系統(tǒng)：將裝填后的空柱與層析系統(tǒng)(如AKTA、手動(dòng)泵)連接時(shí)，確保接口螺紋擰緊(避免漏液)，并用緩沖液預(yù)平衡柱床(至流出液pH/電導(dǎo)率與進(jìn)料液一致)。
2.上樣操作：
•樣品需經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，上樣流速控制在0.1-0.5mL/min；
•若樣品黏度高，需稀釋或離心后上樣，避免柱床塌陷。
3.清洗與洗脫：
•先用平衡緩沖液清洗未結(jié)合雜質(zhì)；
•再用特異性洗脫液溫和洗脫目標(biāo)分子，避免劇烈pH變化導(dǎo)致蛋白變性。
四、安全注意事項(xiàng)
1.生物安全：若處理病原體或毒性樣品，需在BSL-2及以上實(shí)驗(yàn)室操作，廢棄填料與緩沖液按生物危害廢物處理。
2.化學(xué)安全：避免接觸強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或有機(jī)溶劑，若不慎接觸皮膚需立即用大量清水沖洗并就醫(yī)。
3.物理安全：裝填時(shí)防止篩板脫落砸傷手部，高壓洗脫時(shí)遠(yuǎn)離接口處，避免爆管傷人。
五、維護(hù)與存儲(chǔ)
使用后需用20%乙醇或0.1M NaOH溶液沖洗空柱并保存，短期存放可保持濕潤(rùn)狀態(tài)，長(zhǎng)期存放建議拆卸篩板與填料，單獨(dú)密封避光保存。
親和層析空柱的操作規(guī)范涵蓋安裝、裝填、使用到維護(hù)全流程，嚴(yán)格遵循每一步驟(如低流速裝填、預(yù)平衡、溫和洗脫)可確保分離效率與柱床壽命；同時(shí)，生物與化學(xué)安全防護(hù)是實(shí)驗(yàn)人員的必須要有的意識(shí)。只有規(guī)范操作與安全意識(shí)并重，才能獲得高純度目標(biāo)產(chǎn)物并保障實(shí)驗(yàn)室安全。
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